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    操作指南

    ?茁彩生物通用樣本處理方法

    2022-02-24

        

      血清

    全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將標本放于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融.

       血漿

    EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內于2 - 8°C 1000g離心20分鐘,或將標本放于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

      組織勻漿

    用預冷的 PBS (0.01mol/L, pH=7.2-7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的 PBS(一般按 1:9 的重量體積比,比如 1g 的組織樣品對應 9mL 的 PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。最后將勻漿液于 5000×g 離心 5~10 分鐘,取上清檢測。

    培養的細胞

    A、動物細胞:用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液,使細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,收集細胞懸液,4℃低(3000rpm,5min),棄上清,加入一定量PBS200ul),輕輕吹打混勻,-20 冷凍30 min(液氮冷凍5min),37℃水浴解凍,如此反復3-5次,可形成細胞裂解液。 

    (如果反復凍融,破碎效果不好,就采用超聲波破碎,破碎條件:用20kHz頻率,150W的功率,在冰浴中進行超聲波破碎,每破碎2s,間隔3s,反復破碎三次。),以使細胞破壞并放出細胞內成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

    B、植物細胞:用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液,使細胞濃度達到100萬/ml左右,置于冰盒上,用超聲破碎儀,設置破碎2s,冷卻30s的方式,充分破碎細胞,以使細胞破壞并放出細胞內成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

    C、組織的細胞切割標本后,稱取1g組織,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器將標本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),去除上清,再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細胞三遍。再用上述的細胞破碎方法破碎細胞。

     植物標本
      (精提)

    1、 稱取0.1g(誤差±3%以內)新鮮植物組織樣本,在液氮中充分研磨;

    2、 加入1ml的提取液(80%甲醇), 置于-20度過夜;

    3、 于4度,8000rpm,離心20分鐘,取上清;

    4、 上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是: 80%甲醇(1ml)平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后用100%甲醇(5ml)洗柱→100%乙醚(5ml)洗柱→100%甲醇(5ml)洗柱→循環。過柱后的樣本真空干燥或氮氣吹干,保存備用;

    5、 上樣前加入pH7.4 PBS緩沖液(1ml定容);靹蚝笫覝胤胖30分鐘,然后4度離心(8000rpm,15分鐘),取上清并暫時保存于4度待用。

     植物標本
      (推薦)

    用預冷的 PBS (0.01mol/L, pH=7.2-7.4)沖洗組織,去除殘留物質(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的 PBS(一般按 1:9 的重量體積比,比如 1g 的組織樣品對應 9mL 的 PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。最后將勻漿液于 5000×g 離心 5~10 分鐘,取上清檢測。

       尿液

    用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

      胸腹水

    用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

      腦脊液

    用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

       牛奶

    用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

       蜂蜜

    用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

       土壤

    稱取1g土壤,加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工將標本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清。

       糞便

    稱取1g糞便,加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工將標本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清。

      咽拭子

    加入2ml的pH7.2-7.4左右的PBS,溶解咽拭子頭部,搖勻,用鑷子取出咽拭子并擠干液體,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清。分裝一份待檢測,其余冷凍備用,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。如果是測分泌蛋白,直接取上清檢測,測試細胞內蛋白,要破碎細胞。


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